Окраска бактерий для определения их кислотоустойчивости

Бактериоскопическое исследование мокроты

Окраска бактерий для определения их кислотоустойчивости

Для проведения данных исследований необходимо следующее оснащение рабочего места:

  1. Предметные и покровные стекла.
  2. Шпатели и иглы.
  3. Смесь Никифорова.
  4. Газовая или спиртовая горелка.
  5. Пастеровская пипетка с резиновым баллончиком.
  6. Водяная баня с мостиком.
  7. Иммерсионное масло.
  8. Микроскоп.
  9. Фильтровальная бумага.
  10. Пинцеты Корне.
  11. Бумажки Синева.
  12. Основной фуксин.
  13. 96° этиловый спирт.
  14. Фенол.
  15. Глицерин.
  16. Концентрированная соляная кислота.
  17. Метиленовая синька.
  18. Дистиллированная вода.
  19. Генцианвиолет.
  20. Реактив Люголя.
  21. Едкий натр (NaOH).
  22. Бензин или ксилол.

Приготовление препаратов для бактериоскопического исследования

Для бактериоскопического исследования готовят обычно два препарата: один для обнаружения микобактерий туберкулеза и другой для обнаружения прочих микроорганизмов.

Для первого препарата отбирают те же частицы, которые были предназначены для микроскопии, для второго — гнойные частицы.

[attention type=yellow]

Взятый материал распределяют по предметному стеклу до получения достаточно тонкой ажурной сеточки (материал на первом стекле распределяют на 2/3 его поверхности, на втором — в центре).

[/attention]

Оба препарата фиксируют троекратным проведением над пламенем горелки. Первый препарат окрашивают по Цилю — Нильсену, второй — по Граму.

Окраска по Цилю-Нильсену

Для окраски препаратов по Цилю-Нильсену необходимы следующие краски и реактивы:

  1. Фуксин Циля: основного фуксина 1 г, глицерина 4 капли, этилового спирта 96° 10 мл, карболовой кислоты (5% раствор фенола) 5 мл, дистиллированной воды 90 мл. К фуксину, помещенному в фарфоровую ступку, прибавляют глицерин, хорошо растирают, постепенно приливают карболовую кислоту, спирт и воду. Фильтруют.
  2. 3% раствор солянокислого спирта: 3 мл концентрированной соляной кислоты удельного веса 1,19 и 97 мл 96° этилового спирта.
  3. 0,2 % водный раствор метиленовой синьки — 1 г метиленовой синьки растворяют в 500 мл дистиллирован- вой воды.   

Техника окраски. На фиксированный препарат кладут полоску фильтровальной бумаги (уже и короче предметного стекла), на которую наливают в избытке фуксин Циля.

Затем препарат нагревают до появления паров (достаточно троекратно медленно провести его над пламенем горелки), дают ему остыть в течение 3-5 минут, сбрасывают с помощью пинцета бумажку, промывают препарат водой и наливают на него 3% раствор солянокислого спирта для обесцвечивания на 20 секунд. После этого препарат промывают водой и вновь повторяют обесцвечивание. Материал должен быть серовато-розового цвета. Затем на препарат на 20-30 секунд наливают 1: 500 водный раствор метиленовой синьки, краску сливают, препарат промывают водой и высушивают, установив в вертикальном положении на полоску фильтровальной бумаги.

Высушенный препарат рассматривают под микроскопом с иммерсией, с поднятым конденсором.

В препарате микобактерии туберкулеза (рис. 60) красного цвета, нежные, тонкие, слегка изогнутые, иногда зернистые. Иногда обнаруживают микобактерип туберкулеза в виде так называемых осколков (в составе тетрады Эрлиха).

Рис. 60. Микобактерии туберкулеза в мокроте. 1 – окраска по Цилю-Нильсену, 2 – в люминесцентном микроскопе.

Все остальные элементы, в том числе и другие микроорганизмы, окрашены в синий цвет. С целью обнаружения мпкобактерий туберкулеза препарат тщательно исследуют, продвигая от одного продольного края к другому и поперек мазка.

Во всех сомнительных случаях рекомендуют обработать препараты жавелевой водой
Результат исследования оформляют, используя следующую формулировку: «микобактерип туберкулеза не обнаружены» или «микобактерип туберкулеза обнаружены», и отмечают приблизительное их количество, например, «единичные в препарате», «единичные в поле зрения» и т. д.

В настоящее время находит все большее распространение люминесцентный способ обнаружения микобактерий туберкулеза в мокроте. Микобактерип туберкулеза имеют золотисто-желтое свечение на черном фоне препарата (рис. 60, 2).

В тех случаях, когда количество микобактерий туберкулеза в мокроте незначительно, для их обнаружения применяют метод обогащения (флотация), который состоит в следующем. В бутылку с нешироким горлышком (емкостью 250 мл) помещают 12-20 мл мокроты, добавляют равный объем 0,5% раствора КОН и встряхивают 5-10 минут.

Затем приливают около 10 мл дистиллированной воды и 0,5-1 мл бензина или ксилола, взбалтывают 10-15 минут и доливают дистиллированную воду гак, чтобы горлышко бутылки было заполнено. Смесь оставляют на 1-2 часа до образования на поверхности жидкости сливкообразного слоя.

[attention type=red]

На два предметных стекла, заранее расположенных на мостике над водяной баней, нагретой до 60-65°, каплями, с помощью пастеровской пипетки, 5-6 раз наносят сливкообразный слой, каждый раз после подсыхания предыдущей капли.

[/attention]

Мазки окрашивают фуксином Циля на водяной бане (без дополнительной фиксации) в течение 10 минут, промывают водой, 3-4 минуты обесцвечивают 3% раствором солянокислого спирта, вновь обмывают водой, докрашивают 0,2% водным раствором метиленовой синьки, высушивают и исследуют под микроскопом.

Окраска по Граму

Для окраски препаратов по Граму требуются следующие краски и реактивы:

  1. Разведенный фуксин Циля (фуксин Пфейффера): 1 часть фуксина Циля + 9 частей дистиллированной воды.
  2. Реактив Люголя.
  3. 1 % спиртовой раствор генцианвиолета — 1 г генцианвиолета растворяют в 100 мл 96° этилового спирта. Этот раствор краски можно заменить бумажкой, приготовленной по методу Синева (белую фильтровальную бумажку пропитывают 1% спиртовым раствором генцианвиолета, затем высушивают и разрезают на мелкие квадратики соответственно размеру мазка).

Техника окраски. На фиксированный препарат накладывают бумажку Синева и смачивают ее водой (при отсутствии бумажки Синева ее заменяют белой фильтровальной бумажкой, на которую наносят несколько капель 1% спиртового раствора генцианвнолета). Через 1-2 минуты бумажку сбрасывают и на препарат наливают 1-2 капли реактива Люголя.

Через 1-2 минуты препарат обесцвечивают 1-2 каплями 96° этилового спирта до появления бледно-серой окраски материала, смывают водой, на 10-15 секунд наносят сруксин Пфейффера, после чего вновь смывают водой и высушивают. В препаратах могут быть обнаружены (рис.

61) стафилококки, стрептококки, диплококки, палочки Пфейффера, спирохеты Плаута-Венсана, актиномицеты и другие микроорганизмы.

Рис. 61. Различные микроорганизмы в мокроте: диплококки (1), палочки Пфейффера (2), стрептококки (3), стафилококки (4), диплобациллы Фридлендера (5), симбиоз Венсана (6), мицелий актиномицет (7).

Обеззараживание мокроты, посуды и предметов, бывших в соприкосновении с ней

После проведенного исследования мокроту сжигают или обеззараживают. Последнее достигается следующими способами: а) автоклавированием в течение одного часа при 1,5 атм.

; б) кипячением в течение одного часа в 1-2% растворе соды; в) обработкой 5% раствором лизола, карболовой кислоты или смесью, состоящей из равных объемов 5% раствора хлорамина и 5% раствора сернокислого аммония, в течение 12-24 часов.

После обеззараживания посуду тщательно моют водой и высушивают.

Металлические предметы (шпатели, иглы) обеззараживают прокаливанием над огнем. Во избежание переноса микроорганизмов из одной порции мокроты в другую шпатель и иглу немедленно прокаливают после отбора соответствующих частиц.

Покровные стекла опускают в небольшую плоскую чашечку с 40% раствором серной кислоты на 12-24 часа. Затем кислоту сливают, а стекла неоднократно промывают водопроводной и дистиллированной водой. Вымытые стекла высушивают и используют для последующих исследований.

Источник: http://ginekolog.my1.ru/publ/klinicheskie_issledovanija/mokrota/bakterioskopicheskoe_issledovanie_mokroty/40-1-0-771

Кислотоустойчивые бактерии: особенности выявления в микробиологии и таксономии

Окраска бактерий для определения их кислотоустойчивости

Несмотря на свое название, кислотоустойчивые бактерии предпочитают расти на нейтральных средах.

Их устойчивость к перепадам кислотности внешней среды обусловлена особым строением клеточной стенки и составом клеточного содержимого.

Окраска таких бактерий карболовым фуксином в красный цвет является очень стойкой – в результате кислотоустойчивые микроорганизмы не обесцвечиваются после обработки их раствором серной кислоты.

В данную группу входят различные таксоны – микобактерии, актиномицеты, бактерии, способные к азотфиксации. Таксономия выделяет их в отдельную межвидовую группу.

Повышенной кислотоустойчивостью отличаются также споры ряда бактерий – спящие формы, окруженные плотной оболочкой и имеющие повышенную устойчивость к неблагоприятным условиям внешней среды.

Процесс образования спор занимает у бактериальной колонии 18-20 часов, а просыпаются они при наступлении благоприятных условий за 4-5 часов.

Окрашивание

Интересно, что термин кислотоустойчивые бактерии применяется к микроорганизмам, не в плане их экологических особенностей, а в том смысле, что они окрашиваются по Цилю-Нильсену и не обесцвечиваются после окраски слабыми растворами кислот и этанолом.

Эти методы позволяют успешно выявлять кислотоустойчивые формы в мазках. Однако обнаружены и такие особенности этих бактерий, как устойчивость к повышенному содержанию в среде кислот и щелочей.

Кислотоустойчивые формы бактерий считаются грамположительными, поскольку таксономия этих организмов основана на толщине их стенок, которую демонстрирует окраска по Граму.

Стандартные методы окрашивания (например, окраска по Граму) не дают удовлетворительных результатов. Кислотоустойчивые бактерии окрашиваются по Граму, только если применяются большие концентрации красителей или высокие температуры. Такие препараты кислотоустойчивых бактерий можно длительно хранить.

Для выявления кислотоустойчивых бактерий в мазке применяют следующие препараты:

  1. Генциан фиолетовый, 1% феноловый или спиртовой раствор.
  2. Раствор Люголя, содержащий кристаллический йод и йодид калия.
  3. Этиловый спирт 96%.
  4. Фуксин Пфейффера (фуксин Циля смешивается с дистиллированной водой в пропорции 1:9).

Окраска производится после фиксации стандартных препаратов на пламени. После этого на него накладывают фильтровальную бумагу, смоченную фуксином Циля, и нагревают стекло над пламенем 5 минут, не допуская закипания жидкости. Препарат не должен высыхать. После завершения фиксации его промывают большим количеством воды под малым напором.

После высыхания мазка его обрабатывают слабыми растворами серной или соляной кислоты и еще раз промывают водой. Заключительным этапом является окраска метиленовым синим (краситель Леффлера).

Окраска по Цилю-Нильсену является одним из методов выявления возбудителей туберкулеза и проказы. Таксономия относит их к числу грамположительных организмов.

Кислотоустойчивость и строение клетки

Наиболее часто бактерии, обладающие кислотоустойчивостью, микробиология описывает среди микобактерий и актиномицетов.

Это связано с особенностью строения их клеточной стенки, содержащей миколовые кислоты, небольшое количество липидов, тейхоевых кислот, полисахаридов и полипептидов, а также воска.

Используя методы выявления кислотоустойчивости, микробиологи узнали много нового о строении бактериальных спор и клеточной стенки.

Обнаружено сходство клеточных стенок кислотоустойчивых бактерий и бактериальных спор, обуславливающее их свойства.

Разновидности

Методы выявления кислотоустойчивости разрабатывались для патогенных микроорганизмов – возбудителей туберкулеза и проказы.

Однако постепенно среди кислотоустойчивых бактерий обнаружились сапрофитные формы, обладающие аналогичными свойствами клеточной стенки.

Они имеют ряд отличий (быстрый рост в культуре, более быстрое или, наоборот, медленное обесцвечивание этанолом), однако для их выявления применяются такие же методы.

[attention type=green]

Аналогичное строение клеточной стенки наблюдается у большинства актиномицетов. Эти малоизученные микроорганизмы всегда присутствуют в пристеночной микрофлоре человека и животных.

[/attention]

В случае ослабления иммунной системы хозяина, они способны вызывать состояния, напоминающие туберкулез.

Эти организмы умеют перерабатывать сложные среды, содержащие парафин, воск, смолу или керосин, производить витамин В12, биотин, рибофлавин, пантотеновую кислоту.

Интерес к актиномицетам стал причиной того, что методы выявления бактерий с характерной клеточной стенкой начали применяться не только для изучения патогенных и сапрофитных бактерий человека и животных.

Так среди азотфиксирующих организмов были обнаружены бейеринкии (Beijerinckia), имеющие высокую устойчивость в средах с различной кислотностью. Выявлена неплохая кислотоустойчивость у некоторых азотфиксирующих клостридиумов (Clostridium).

Исследования с применением изотопов позволили выявить азотфиксирующие формы среди актиномицетов (Actinomyces).

Работаю врачом ветеринарной медицины. Увлекаюсь бальными танцами, спортом и йогой. В приоритет ставлю личностное развитие и освоение духовных практик. Любимые темы: ветеринария, биология, строительство, ремонт, путешествия. Табу: юриспруденция, политика, IT-технологии и компьютерные игры.

Источник: https://probakterii.ru/prokaryotes/species/kislotoustojchivye-bakterii.html

Окраска кислотоустойчивых микроорганизмов

Окраска бактерий для определения их кислотоустойчивости

В природе существуетгруппа микроорганизмов, устойчивых кдействию кислот, щелочей и спиртов. Ониотносятся к роду Mycobacterium(возбудители туберкулеза, паратуберкулезакрупного рогатого скота, проказычеловека).

Химическая структура цитоплазмыи клеточной оболочки микроорганизмовданной группы отличается содержаниемзначительного количества жировосковыхвеществ, в частности стеариновых кислот(в том числе фтионовой кислоты до 40%),поэтому проникновение красителя вклетку затруднено.

Для их окраскииспользуют протравливание (нагреваниемазка с красителем над пламенем).Окрасившись, они прочно удерживаюткраску и не обесцвечиваются кратковременнымдействием кислоты.

Окраска по Циль-Нильсену

1. Фиксированныйна пламени мазок покрывают полоскойфильтровальной бумаги, наливают на неекарболовый раствор фуксина и подогревают;при появлении паров прекращают нагреваниеи оставляют краску на препарате еще нанесколько минут (2—3 минуты). Дав препаратуостыть, удаляют пинцетом бумажку иобмывают мазок водой.

2. Обесцвечиваютпрепарат 5—10% водным раствором сернойкислоты в тече­ние 3—5 секунд (дожелтоватого оттенка мазка). Вместосерной кислоты можно применить 5% растворазотной или 3% раствор соляной кислоты.

  1. Мазок тщательно промывают водой.

  2. Споласкивают 96°спиртом.

5. Снова промываютводой.

6. Докрашивают втечение 3—5 минут леффлеровскойметиленовой синькой или водным раствором1: 1000 малахитовой зе­лени или метиловойзелени.

7. Краску смываютводой и препарат высу­шивают.

Микроскопическаякартина: туберкулезные палочки – рубиновокрасные, остальные, за исключениемвозбудителя паратуберкулеза, кислото- и спиртоустойчивых сапрофитов, – синие.

Для обесцвечивания мазков при окраскепо Циль-Нильсену вместо растворов кислоти спирта особо рекомендуется применениесолянокислого алкоголя (соляной кислоты3 мл+96° спирта 97 мл) до слабо заметногорозоватого оттенка препарата. Послеэтого мазок ополаскивают водой идокрашивают метиленовой синькой и т.д. по основной прописи.

Указанным методомдостигается одновременное испытаниебацилл на кислото – и спиртоустойчивость.Среди видов кислотоустойчивых сапрофитоввстречаются спиртоподатливыеразновидности, палочки же туберкулезаи паратуберкулеза всегда кислото – испиртоустойчивы.

Занятие 4. Окраска спорообразующих и капсулообразующих бактерий. Определение подвижности микроорганизмов

Цель занятия.Усвоить методы окраски спорообразующих,капсулообразующих бактерий, а такжеопределение подвижности бактерий.

Материалы иоборудование. Взвеси бактерий свакцинным штаммом сибирской язвы,клостридиями, готовые препараты скапсулообразующими бактериями, подвижныебульонные культуры эшерихий 18 часовогороста, предметные и покровные стекла,плакаты, 2% раствор сафранина, водныйраствор малахитовой зелени, карболовыйфуксин Циля.

Методическиеуказания. Каждый студент готовитмазки из взвесей микроорганизмов иокрашивает их по методу Трухильо, Ольта,микроскопирует и зарисовывает; готовитпрепарат для изучения подвижностимикроорганизмов методом «раздавленная»и «висячая» капля.

Окраска спор. Принеблагоприятных условиях для микробов(отсутствие питательной среды, высушивание,неблагоприятная температура и др.) вцитоплазме некоторых микроорганизмовобразуются споры. Формируются они внутривегетативной клетки, являясь эндоспорами.

Палочковидные грамположительныемикроорганизмы, образующие округлыеспоры, диаметр которых не превышаетширину микробной клетки, относятся кродуBacillusи называютсябациллами. Микроорганизмы родаClostridiumимеют споры диаметр которых превышаетширину микробной клетки и называютсяклостридиями.

По форме они бываютовальные и круглые (рис. 5).

Споры устойчивык воздействию высоких температур,химических веществ, к высыханию, длительносохраняются в почве, что объясняетсяих особым строением и химическимсоставом, в особенности ее оболочки.Поэтому споры стойки к действиюкрасителей.

Все методы окраскиспор основаны на обеспечении проникновениякрасителя через трудноокрашиваемуюоболочку споры. Поэтому применяютпротраву. После охлаждения оболочкавновь становится плотной и не пропускаетдополнительный краситель.

Техника окраскиспор методом Трухильо. На фиксированныймазок накладывают небольшой кусочекфильтровальной бумаги и на нее наносятводный раствор малахитовой зелени.

Рис.5. Споры микроорганизмов различных типов

[attention type=yellow]

Подогреваютпрепарат на пламени горелки до появленияпаров и выдерживают в течение 3 минут,промывают водой и докрашивают 0,25%-нымводным раствором основного фуксина 1минуту. Промывают водой и высушивают.Микрокартина: споры зеленые, а вегетативныеклетки красные.

[/attention]

Окраска капсул.Тело микробной клетки покрыто рыхлымслизистым слоем. У некоторых видовмикроорганизмов этот слой развиваетсяочень сильно и тогда он называетсякапсулой. Капсула – муциноподобноевещество, высокомолекулярный полисахарид,является производным наружного слояоболочки.

Наличие капсулы являетсяважным диагностическим признаком приидентификации и дифференциациивозбудителей некоторых инфекций(сибирской язвы, пневмококковой пневмониии др.) (рис. 6). Патогенные микроорганизмыобразуют капсулу в инфицированноморганизме. Она является факторомвирулентности и защищает бактериальнуюклетку от фагоцитоза и бактерицидногодействия сыворотки крови.

Капсульноевещество плохо окрашивается. Поэтомупри приготовлении препарата дляобнаружения капсулы выполняют следующиеправила:

а) мазок готовятиз свежего материала, так как капсулабыстро лизируется;

б) фиксируют мазокхимическим способом, для окраскиприменяют метохромотические краски,то есть при использовании, которыхцитоплазма окрашивается в один цвет, акапсула – в другой;

в) промывать мазокводой следует слабо и кратковременно.

Техника окраскакапсул по методу Ольта. Свежий горячий2%-ный раствор сафранина наносят нафиксированный мазок, окрашивают 5-7минут. Быстро промывают водой и высушивают.Тело клетки окрашивается в краснокирпичныйцвет, капсула в – желто-оранжевый.Определение подвижности бактерий.

Подвижностибактерий важный видовой признак ипроизводиться при диагностическихисследованиях: результат учитывают приидентификации микроорганизмов. Уподвижных видов способность самостоятельногопоступательного (и вращательного)движения обусловлена наличием жгутиков– специальных тонких нитевидныхобразований.

Рис.6.Капсулау бактерийа ‑ бацилласибирской язвы; б – диплококк

Жгутики бываютразличной длины.

Их диаметр настолькомал, что они невидимы в световом микроскопе(менее 0,2 мкм). У разных групп бактерийколичество и расположение жгутиковнеодинаково. Жгутики плохо воспринимаюткрасители.

Методы сложной окраскиискажают подлинный вид жгутиков, поэтомув лабораториях окраску жгутиков неосуществляют, а исследуют бактерии вживом состоянии.

В зависимости отрасположения и количества жгутиковмикробы подразделяют (рис. 7):

а) монотрихи -микроорганизмы, имеющие на одном изполюсов один жгутик, движения активные,поступательные (псевдомонас);

Рис. 7. Типы расположения жгутиков у бактерий

[attention type=red]

б) лофотрихи– микробы, имеющие на одном из полюсовпучок жгутиков (листерии);

[/attention]

в) амфитрихи– микробы, имеющие жгутики на обоихполюсах микробной клетки;

г) перитрихи -микробы, у которых жгутики расположеныпо всей поверхности клетки(E.coli).

Есть видымикроорганизмов, обладающие подвижностью,но жгутиков не имеют (спирохеты,лептоспиры). Их движение обусловленоимпульсивными сокращениями двигательногофибриллярного аппарата микробнойклетки.

Для определенияподвижности у бактерий необходимоиспользовать культуру не старше суточноговозраста, так как старые культурыутрачивают способность передвигаться.

Определениеподвижности бактерий методом «висячаякапля». Каплю молодой (18-20 часовой)бульонной культуры бактерийбактериологической петлей наносят напокровное стекло.

Специальным предметнымстеклом с углублением (луночкой) накрываюткаплю культуры так, чтобы покровноестекло с каплей находилось в центрелуночки и прилипло к предметному стеклу(края луночки предварительно слегкасмазывают вазелином). Препаратперевертывают стеклом вверх, и капля«повисает» над луночкой (рис. 8).

Препаратмикроскопируют при затемненном полезрения, сначала при малом, затем присреднем или большом увеличении. Насветлом фоне микробы темно-серые.Методом Шукевича. Для этого каплюмикробной взвеси наносят в конденсатскошенной плотной питательной среды впробирке.

Подвижные микроорганизмы,передвигаясь из конденсата, растут наповерхности среды; неподвижные видыразмножаются только в конденсате среды(«не заходя» на поверхность агара).

Рис. 8. Исследование микробов на подвижностьа ‑ стекло с луночкой; б ‑ «висячая капля»

Метод «раздавленнаякапля». Каплю бактериальной взвесинаносят на обычное предметное стекло,осторожно накрывают покровным стекломи слегка придавливают пальцем. Микроскопиюпроводят, так же как и в методе «висячаякапля».

Метод посевауколом в полужидкий агар. Для этогобактериологическойпетлей производятпосев исследуемой культуры уколом додна пробирки с полужидкой питательнойсредой. Подвижная культура растет повсей питательной среде, образуяравномерное помутнение, а неподвижная- только по уколу в виде стержня, сохраняяпрозрачность незасеянного участкасреды.

ЗАНЯТИЕ5. Лабораторная посуда и её подготовка.Питательные среды. Методы приготовленияи стерилизации питательных сред. Методыстерилизации лабораторной посуды.

Цель занятия.Подготовить посуду. Приготовитьпитательные среды. Определить рН сред.Ознакомиться с методами стерилизациипитательных сред и лабораторной посуды.

Оборудование иматериалы.Штативы, пробирки, микробиологические петли, пипетки,чашки Петри, бумага. Автоклав,сушильный шкаф. Набор сред и химическихреактивов. рН -метр.

Источник: https://studfile.net/preview/1152683/page:5/

Лечимся дома
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: