Определение токсигенности дифтерии

Определение токсигенности дифтерии

Определение токсигенности дифтерии

С целью раннего выявления дифтерии и определения носителей дифтерийной палочки необходимы выделение и идентификация возбудителя, а также определение его способности к токсинообразованию. Материалом для исследования служат дифтеритические плёнки, слизь из носоглотки или отделяемое из подозрительных поражений кожных покровов.

Забор материала на дифтерию проводят двумя стерильными тампонами: один используют для посева, с другого делают мазки и окрашивают их по Граму и Найссеру. Взятый материал следует доставлять в лабораторию не позднее чем через 3 ч.

Бактериоскопия дифтерийной палочки

Окраска по Граму не является специфичной, так как дифтерийные палочки сравнительно плохо воспринимают красители, но позволяет косвенно идентифицировать непатогенные коринебактерии, располагающиеся в виде палисада (параллельно) или в виде китайских иероглифов. Окраска по Найссеру позволяет выявить характерные зёрна Бабеша-Эрнста и отличить дифтерийную палочку от ложнодифтерийной палочки С. pseudodiphtheriticum (С. hofmannii), часто обитающей в носоглотке.

Культивирование дифтерийной палочки

Бактерии дифтерии выделяют посевом на элективные среды с теллуритом (например, Клауберга II или Маклёода), ложнодифтерийная палочка (палочка Хофманна) теллур не восстанавливает (см. рис. 8 на вклейке).

Для выделения чистой культуры дифтерии часть подозрительной колонии засевают на скошенный агар (или среду Ру), вторую часть — на твёрдую питательную среду для определения токсигенности и (не обжигая петли) проводят определение цистиназной активности (проба Пизу). При положительном результате наблюдают образование коричневого облачка вокруг линии укола. Чистую культуру идентифицируют на средах Хйсса, пользуясь укороченным пёстрым рядом (глюкоза, мальтоза, сахароза, мочевина), что позволяет отличить С. diphtheriae от непатоген пых коринебактерии (рис. 14-3).

Для идентификации биоваров дифтерии используют «длинный» ряд углеводов, включающий крахмал и гликоген. Для полной идентификации можно исследовать способность бактерий расти в анаэробных условиях посевом уколом в столбик 0,5% сахарного агара (растёт только С. diphtheriae).

Определение токсигенности дифтерийной палочки

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vivo. Проводят подкожным или внутрикожным заражением 0,5-1,0 мл бактериальной культуры морских свинок массой 250 г. За 24 ч до заражения одно животное иммунизируют дифтерийным антитоксином. При положительном результате неиммунизированные животные погибают в течение 3-5 сут.

Определение токсигенности дифтерийной палочки in vitro. Способность к образованию токсина можно определять заражением куриных эмбрионов или культур клеток с регистрацией последующего цитопатнческого эффекта. Можно использовать твердофазный ИФА с использованием антитоксинов, меченных пероксидазой.

Также предложены ПЦР и ДНК-зонды для обнаружения гена tox в бактериальной хромосоме. Однако наибольшее распространение получил тест иммунодиффузии Илека.

На среду с пониженным содержанием Fe2+ (для более интенсивного токсинообразования) проводят посев исследуемого изолята и эталонных токсигенного и нетокси-генного штаммов параллельными штрихами. На выросшие колонии накладывают полоску фильтровальной бумаги, пропитанной дифтерийным антитоксином.

[attention type=yellow]

Образующийся токсин и антитоксин диффундируют в агар и в месте встречи образуют линии преципитации, так называемые «усы» или стрелы. На практике используют модификацию метода. Полоску бумаги, пропитанную антитоксином (500 ME в 1 мл), наносят на чашку, а исследуемые культуры засевают бляшками по обе стороны бумажной полоски.

[/attention]

Контролем служит заведомо токсигенная культура, также посеянная «бляшкой». В результате встречной диффузии токсина и антитоксина в месте их контакта выпадает линия преципитации, сливающаяся с линией преципитации токсигенного штамма.

Фаготипирование дифтерийной палочки

Для дифференциальной диагностики возбудителей используют набор из 9 кори нефагов. С его помощью можно типировать большинство токсигенных и нетоксигенных штаммов биовара gravis.

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде.

В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или “усов”.

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

Культуру засевают в виде “бляшек” диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 “бляшек”.

Из них 6 “бляшек” испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных “бляшек” и 4 — испытуемых.

Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки.

[attention type=red]

Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты).

[/attention]

Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки.

Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты.

Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Источник: https://UziMaster.ru/opredelenie-toksigennosti-difterii/

Патогенетическая микробиология (часть 2) | Издательство ПИМУ – Part 3

Определение токсигенности дифтерии

Подобно всем бактериальным токсинам, действующим внутриклеточно, дифтерийный токсин является бинарной молекулой, т.е. состоит из двух фрагментов — А и В, выполняющих соответственно ферментативную (расщепление НАД, АДФ-рибозилирование) и рецепторную функции.

Фрагмент В связывается с рецепторами клеток (гепаринсвязывающим эпидермальным фактором роста), способствуя внутриклеточному транспорту А-компонента. Этому сопутствует расщепление молекулы токсина мембранными протеазами и высвобождение активированного А-фрагмента.

Полагают, что высокая чувствительность к дифтерийному токсину миоцитов сердца и нервных клеток объясняется повышенным содержанием в них гепаринсвязывающего эпидермального ростового фактора.

Определение токсигенности изолированной культуры венчает микробиологический анализ при подозрении на дифтерию: лишь выделение токсигенных культур имеет диагностическое значение.

Дифтерийная палочка активно продуцирует токсин, поэтому для его обнаружения вполне достаточно не очень чувствительного, но весьма демонстративного метода двойной (встречной) иммунодиффузии в геле, который по автору называется реакцией Оухтерлони (рис. 4).

Рис. 4. Определение токсигенности C. diphtheriae (реакция гелевой иммунодиффузии по Оухтерлони). Горизонтально расположена полоска бумаги, пропитанная антитоксической сывороткой. Три культуры дифтерийной палочки посеяны перпендикулярно полоске с антитоксином. Токсигенные штаммы дают V-образную линию преципитации, которая формируется в зоне оптимального соотношения антиген—антитело.

Штаммы в центре и слева продуцируют токсин (линии преципитации сливаются). Штамм, посеянный справа, лишен токсигенности. Культивирование на элективной среде в течение 48 ч при 37,5оС с последующей экспозицией 48 ч при 4оС

Представления о дифтерии как о специфической интоксикации сыграли решающую роль в борьбе с этой инфекцией.

Выздоровление связано с образованием антител, нейтрализующих токсин. Этому можно содействовать, вводя больному готовые антитела в виде антитоксической сыворотки или ее иммуноглобулиновой фракции. Антитоксическую сыворотку получают от гипериммунизированных лошадей, так что следует считаться с возможностью аллергических осложнений на введение чужеродного (гетерологичного) белка.

Они бывают разной тяжести и наблюдаются примерно в 10% случаев. Но это терапия выбора и начинать ее следует как можно раньше, так как, нейтрализуя свободный токсин, антитела бессильны против токсина, связавшегося с клетками, а тем более уже проникшего в них. Это означает, что сигналом к иммунотерапии должен быть клинический диагноз дифтерии.

Выделение токсигенной культуры служит хоть и важным, но все-таки запоздалым подтверждением. Антибиотики приносят пользу, но не заменяют антитоксина.

Блестящим развитием идеи о дифтерийной интоксикации явилась разработка подходов к искусственному созданию активного иммунитета против дифтерии. В 1920-х гг. французским ученым Г. Рамоном разработан способ обезвреживания (детоксикации) дифтерийного токсина с сохранением его иммуногенных свойств.

Такой препарат (он называется анатоксином) получают путем обработки токсина 0,3% раствором формальдегида, который сшивает остатки лизина и тирозина, образуя метиленовые мостики. Анатоксин не связывается с клеточными рецепторами, не обладает АДФ-рибозил-трансферазной активностью и не расщепляется на А—В-фрагменты.

Этим объясняется его полная безвредность. Глобальное применение анатоксина для вакцинации детей (его обычно применяют в виде преципитата на гидроокиси алюминия — адсорбированный анатоксин) привело к резкому сокращению дифтерии.

[attention type=green]

Многочисленными исследованиями доказано, что восприимчивость к дифтерии зависит от уровня антитоксического иммунитета, и лишь нарушения в вакцинной практике срывают программу ликвидации этой инфекции. Это, в частности, привело к недавнему росту заболеваемости дифтерией на территории бывшего Советского Союза. Так, в 1994 г.

[/attention]

было зафиксировано почти 50 000 случаев дифтерии, из которых 1750 закончились смертельным исходом. Болели преимущественно взрослые и дети старшего возраста, утратившие иммунитет и не восполнившие его дефицит путем своевременной ревакцинации.

Антитоксические антитела с опережением нейтрализуют токсин, образующийся во входных воротах инфекции. Это исключает повреждение тканей, предупреждая образование фибринозных пленок, которые стабилизируют инфекцию, способствуя ее патогенетически значимой эволюции.

Без такой опоры дифтерийная палочка обычно надолго не задерживается на слизистых оболочках.

Впрочем, как уже говорилось, примеры бессимптомного носительства токсигенных штаммов дифтерийной палочки на фоне протективных титров антитоксических антител, а также присутствие в зеве ее нетоксигенных вариантов говорят о том, что токсин не является обязательным фактором колонизации.

Совершенно очевидно, что подобно другим коринебактериям дифтерийная палочка располагает поверхностными структурами, которые обеспечивают ее адгезию на эпителиоцитах. Их природа не известна, но это рождает естественное стремление расширить тактику превентивной борьбы против дифтерии.

Главные идеи связаны с предупреждением колонизации слизистых оболочек и эпидемиологически значимого носительства возбудителя. Надежды возлагаются на вакцинные препараты из компонентов самих бактерий, т.е. на создание антибактериального иммунитета, который смог бы усилить элиминирующие потенции антитоксических антител.

Хочется верить, что эта логика принесет плоды, но она должна базироваться на грамотных представлениях о факторах микробной колонизации и не повторять тщетных попыток прошлого. У человечества уже есть «синица в руках» — анатоксин, который отлично зарекомендовал себя в борьбе с дифтерией. Не исключено, что «журавль в небе» не понадобится, если организованно поддерживать классический опыт анатоксиновой иммунопрофилактики.

Микобактерии туберкулеза

По опустошительному своему действию туберкулез занимает первое место среди других болезней.
Энциклопедический словарь Брокгауза—Эфрона, 1902

  • Экологические разновидности микобактерий.
  • Клеточная стенка: микробиологическое и патогенетическое своеобразие туберкулезной палочки.
  • «Болезнь макрофагов».
  • Туберкулезная гранулема: эволюция неспецифических и специфических механизмов.
  • Аллергия и иммунитет.
  • Болезнетворность: прямые и опосредованные эффекты.
  • Персистенция, реактивация и патогенетические варианты туберкулеза.
  • Специфическая диагностика: возможности, ограничения, перспективы.
  • Вакцинопрофилактика: иллюзия безопасности.
  • Этиотропная терапия: классика и тревоги будущего.

Название болезни «туберкулез» происходит от характерного патоморфологического признака — специфической гранулемы, или туберкула. Это очаг хронического, иммунологически зависимого воспаления, которое в типичном виде выглядит как небольшой бугорок (лат. tuberculum), внешне и гистологически отличающийся от гранулем иного происхождения.

Слово «туберкул» впервые употребил в XVI в. Ф.Сильвий при описании поражений легких у людей, умерших от чахотки (греч. phtisis — истощение; отсюда — фтизиатрия, фтизиатр). В качестве самостоятельного понятия «туберкулез» стали использовать в XIX в. после того, как Ж.Бейль и Р.

Лаэннек доказали, что образование туберкулов — непременный спутник болезни.

Туберкулез известен с глубокой древности и почти наверняка причинил человечеству больше страданий, чем любая другая инфекция. Несмотря на блестящие достижения этиотропной терапии, он и сегодня остается тревожной проблемой. Прогноз ВОЗ в 1960 г.

о том, что туберкулез в ближайшее время будет ликвидирован как широко распространенное заболевание, не состоялся, и уже в 1993 г. было заявлено, что туберкулезная инфекция выходит из-под контроля. В современных публикациях туберкулез часто упоминается среди так называемых возрождающихся и вновь возникающих (англ. emerging/reemerging) инфекций.

Ежегодно на Земном шаре от туберкулеза умирает более 3 млн. человек, и вряд ли следует ожидать быстрого улучшения ситуации.

[attention type=yellow]

Догадки о заразности туберкулеза восходят к далекому прошлому, но лишь в 1868 г. Ж. Вильмену удалось воспроизвести заболевание у животных при заражении мокротой от больных туберкулезом.

[/attention]

Удивительно, но эти исследования (как и более поздние работы Ю.Конгейма) не убедили современников.

Туберкулез продолжали связывать с самыми невероятными «капризами природы», и лишь работы Роберта Коха утвердили его инфекционное начало.

В марте 1882 г. на заседании Берлинского физиологического общества Кох сообщил о своих исследованиях по этиологии туберкулеза. В мокроте туберкулезных больных он обнаружил палочки, которые по тинкториальным свойствам и росту на питательных средах отличались от всех известных тогда бактерий.

Заражение чистыми культурами вызывало туберкулезный процесс у животных. В докладе было немало и других сведений о происхождении одной из самых страшных болезней человека. Нельзя не поражаться огромной творческой силе, которая потребовалась Коху, чтобы выполнить поставленные перед собой задачи.

Дело в том, что туберкулезная палочка не выявляется при обычной окраске, растет во много раз медленнее других бактерий, а ее выделение в чистой культуре представляет трудности даже для современных бактериологов. Исследования по туберкулезу явились главным основанием для присуждения Р.

Коху одной из первых Нобелевских премий по медицине.

Таксономия и разновидности

Туберкулез человека вызывают два вида микобактерий — Mycobacterium tuberculosis и Mycobacterium bovis (микобактерии бычьего типа). Их нетрудно различить по ряду признаков, но этого часто не требуется, так как современный туберкулез обычно связан с М. tuberculosis.

Если быть точнее, следует говорить о так называемом туберкулезном комплексе, или группе М. tuberculosis. Кроме М. tuberculosis и М. bovis сюда входят еще два вида микобактерий — М. africanum и М.microti. Из них лишь М.

africanum изредка вызывает туберкулез у человека, причем не только среди жителей Африки (как следует из видового эпитета), но и в других регионах. Памятуя о микробиологической неоднозначности туберкулеза, мы тем не менее будем ориентироваться на главный вид, М.

[attention type=red]

tuberculosis, с которым связано более 90% случаев туберкулеза, регистрируемых на Земном шаре. Кроме того, М. tuberculosis и М. bovis так похожи, что некоторые специалисты до сих пор считают их вариантами одного вида.

[/attention]

Источник: https://medread.ru/patogeneticheskaya-mikrobiologiya-2/3/

Лечимся дома
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: