Плазмидные мутации

Плазмиды – это… Функция плазмид

Плазмидные мутации

В этой статье содержится информация о загадочных и сложных молекулярных структурах различных клеток, чаще бактерий, – плазмидах. Здесь вы найдете информацию об их строении, предназначении, способах репликации, общей характеристике и многом другом.

Чем являются плазмиды

Плазмиды – это ДНК-молекулы, которые имеют маленький размер и по физическому положению отделяются от клеточных хромосом геномного типа. Имеют способность к автономному процессу репликации. В основном плазмиды встречаются в бактериальных организмах. Внешне это молекула, имеющая кольцевой двухцепочечный вид. Крайне редко плазмиды можно встретить у архей и эукариотических организмов.

Как правило, плазмиды бактерий содержат генетическую информацию, способную повысить устойчивость организма к факторам внешней природы, негативно влияющим на состояние организма, в котором они находятся.

Иными словами, плазмиды могут снижать эффективность антибиотиков в связи с повышением устойчивости самой бактерии. Часто встречается процесс передачи плазмид от бактерии к бактерии.

[attention type=yellow]

Плазмиды – это структурные элементы, являющиеся средством действенного переноса генетической информации горизонтальным способом.

[/attention]

Д. Ледерберг – молекулярный биолог, ученый родом из США, ввел понятие плазмида в 1952.

Размерные величины плазмид и их численность

Плазмиды – это структуры, имеющие самые разнообразные величины.

Мельчайшие формы могут содержать в себе около двух тысяч парных оснований или меньше, в то время как другие, крупнейшие формы плазмид, заключают в себе по несколько сотен тысяч оснований парного типа.

Знание этого позволяет провести черту между мегаплазмидами и мини-хромосомами. Существуют бактерии, способные заключать в себе плазмиды различного типа. При этом общая сумма их генетического материала может превосходить размер материала клетки-хозяина.

Количество копий плазмид, находящихся в одной клетке, может сильно варьироваться. Например, в одной клетке их может быть всего пара, в то время как в другой число плазмид одного типа доходит до десятков или же сотен. Количество их обусловлено репликационным характером.

Плазмиды – это клеточные структурные элементы способные к автономной репликации. То есть они могут реплицироваться самостоятельно, не подвергаясь контролю хромосомы.

В то же время хромосома может контролировать сами плазмиды. В случае со строгим контролем количество реплицируемых плазмид обычно мало, около 1-3.

Плазмиды мелких размеров чаще подвергаются ослабленному виду контроля и могут создавать большее количество копий.

Процесс репликации

Бактериальные плазмиды способны автономно реплицироваться. Однако данный процесс в разной степени подвергается хромосомному контролю. Это обуславливается отсутствием некоторых необходимых генов. Ввиду этого в процесс репликации плазмид включаются клеточные ферменты.

Этап репликации делится на стадию инициации, элонгации и терминации. ДНК-полимераза начнет репликацию лишь после ее затравки при помощи праймера. Сначала открывается цепь и происходит праймирование РНК, следом разрывается одна из цепей и образуется свободный 3`-OH конец.

Чаще всего этап инициации происходит под действием белков-катализаторов, кодируемых плазмидой. Иногда эти же белки могут вступать в процесс віработки праймера.

[attention type=red]

Элонгация происходит при помощи голофермента ДНК-полимеразы III (иногда I) и некоторых клеточных белках, состоящих в реплисоме.

[/attention]

Терминация репликации может начинаться лишь при наличии некоторых условий.

Принципы репликационного контроля

Контроль механизмов репликации осуществляется на этапе репликационной инициации. Это позволяет удерживать численность плазмид в строгом количестве. К молекулам, способным осуществлять его, относятся:

  1. РНК, имеющие противоположную полярность.
  2. ДНК – последовательность (итерон).
  3. РНК, имеющие противоположную полярность, и белки.

Данные механизмы обуславливают частоту повтора циклов воссоздания плазмид внутри клетки, они также фиксируют любые отклонения от нормы частоты.

Виды механизмов репликации

Существует три механизма репликации плазмид:

  1. Тета-механизм состоит из этапа расплетания 2-х цепей родителей, синтеза праймера РНК на каждой цепи, репликационной инициации за счет нарастания ковалентного типа пРНК на обоих цепях и синтеза соответствующей цепочки ДНК на родительских цепях. Несмотря на то что процесс синтеза происходит одновременно, одна из цепей является лидером, а другая отстает.
  2. Замещение цепи – вытеснение новосинтезированной цепью ДНК одной из родительских. В результате такого механизма образуется ДНК кольцевой формы одноцепочного типа и суперспирализованная ДНК с двумя цепями. ДНК из одной цепочки позже будет восстанавливаться.
  3. Механизм репликации катящегося кольца – представляет собой разрыв одноцепочной ДНК при помощи белка Rep. В результате этого образуется группа 3`-OH, которая будет выступать в роли праймера. Данный механизм протекает при помощи различных белков клетки-носителя, например, хеликазы ДНК.

Способы передачи

Плазмиды попадают в клетку, используя один из двух путей. Первый путь – это установление контакта между клеткой-носителем и клеткой, которая не содержит плазмид, в результате процесса конъюгации.

Существуют конъюгативные плазмиды у бактерий грамположительных и грамотрицательных. К первому способу также относятся передачи в момент трансдукции или трансформации.

Второй путь осуществляется искусственно, путем внедрения плазмид в клетку, при этом организм должен пережить экспрессию генов клетки-носителя, то есть приобрести компетентность клетки.

Выполняемые функции

Роль плазмид, как правило, заключается в придании клетке-носителю определенных свойств.

Некоторые из них могут практически не влиять на фенотипические характеристики своего хозяина, в то время как другие способны вызвать проявление у носителя свойств, дающих ему превосходство над другими такими же клетками.

Это превосходство поможет клетке-хозяину лучше переживать вредные условия среды, в которой она обитает. В случаи отсутствия таких плазмид клетка либо будет плохо расти и развиваться, либо вовсе погибнет.

Плазмиды – это многофункциональная составная клетки. Они выполняют огромнейшее количество функций:

  1. Транспорт генетической информации во время протекания конъюгации. Обычно это делает F-плазмид.
  2. Бактериоциногенные плазмиды контролируют белковый синтез, который может приводить к гибели других бактерий. Этим занимаются в основном Col-плазмиды.
  3. Hly-плазмида занимается синтезом гемолизина.
  4. Обуславливают сопротивляемость воздействию тяжелых металлов.
  5. R-плазмида – повышает сопротивляемость антибиотическим средствам.
  6. Ent-плазмида – позволяет синтезироваться энтеротоксинам.
  7. Некоторые из них увеличивают степень устойчивости к ультрафиолетовому излучению.
  8. Плазмиды колонизационных антигенов позволяют бактериальной адгезии проходить на клеточной поверхности внутри организма животных.
  9. Определенные из их представителей отвечают за разрез ДНК-цепи, то есть за рестрикцию, а также модификацию.
  10. Плазмиды САМ обуславливают камфорное расщепление, плазмиды XYL расщепляют ксилол, а плазмиды SAL – салицилат.

Наиболее изученные виды

Наиболее хорошо человек изучил свойства плазмид F, R и Col.

F-плазмида – это самая известная конъгативная плазмида. Представляет собой эписому, состоящую из ста тысячи оснований парного типа. Имеет собственную точку репликационного начала и точку разрыва. Как и другие плазмиды конъюгативного типа, занимается кодированием белков, способных противодействовать процессу прикрепления пилей остальных бактериальных организмов к стенке конкретной клетки.

Кроме стандартной информации, содержит в себе локусы tra и trb, которые организуют общий, целостный оперон, содержащий в себе тридцать четыре тысячи парных оснований. Гены, находящиеся в этом опероне, отвечают за разнообразные аспекты конъюгации.

R-плазмида (фактор) – является молекулой ДНК и имеет кольцевую форму. ДНК плазмиды заключают в себе информацию, отвечающую за протекание и реализацию процесса репликации и переноса резистентных свойств внутрь клетки-реципиента.

Они же определяют уровень устойчивость клетки определенным антибиотикам. Некоторые из R-плазмид являются конъюгативными. Передача R-фактора происходит в результате трансдукции и стандартного клеточного деления.

Они способны передаваться между отличными друг от друга видами или даже семействами.

Именно эта форма плазмид часто вызывает проблемы в процессе лечения заболеваний бактериальной природы при использовании известных на сегодня антибиотических средств.

Col-плазмиды отвечают за синтез колицина – особенного белка, способного подавлять процессы развития и размножения всех бактерий, кроме самого носителя.

Характеристика классификации

Вся система классификации строится в соответствии с некоторыми свойствами плазмид:

  1. Способы репликации и его механизм протекания.
  2. Наличие общего круга носителей.
  3. Особенности копийности.
  4. Топологические характеристики плазмид.
  5. Совместимость.
  6. Не/конъюгативные плазмиды.
  7. Наличие маркерного гена, находящегося на плазмиде.

Однако в любом способе их классификации содержится точка репликационной инициации.

Области применения плазмид

Функция плазмид при использовании их человеком заключается в способе создания клонированной копии ДНК. Сами плазмиды выступают в роли вектора.

Репликационная способность плазмидов позволяет воссоздавать рекомбинантную ДНК в клетке-носителе. Широкое использование они нашли в генной инженерии.

В этой отрасли науки плазмиды создаются искусственным путем для переноса информации генетического типа или каких-либо манипуляционных действий с генетическим материалом.

[attention type=green]

Понятие об этих клеточных компонентах встречается и в игровой индустрии (“Биошок”). Плазмиды выполняют функцию особых веществ, которые способны придать организму уникальные свойства.

[/attention]

Важно знать, что игровые плазмиды не имеют практически ничего общего с реально существующими.

В игре, выполненной в жанре шутера с элементами RPG, которая называется Bioshock, плазмиды являются генетической модификацией определенных свойств организма, их изменением и способом придания сверхспособностей.

Источник: https://FB.ru/article/322466/plazmidyi---eto-funktsiya-plazmid

Мутации

Плазмидные мутации

Мутации – это изменения в ДНК клетки. Возникают под действием ультрафиолета, радиации (рентгеновских лучей) и т.п. Передаются по наследству, служат материалом для естественного отбора. отличия от модификаций.

Генные мутации – изменение строения одного гена. Это изменение в последовательности нуклеотидов: выпадение, вставка, замена и т.п. Например, замена А на Т. Причины – нарушения при удвоении (репликации) ДНК. Примеры: серповидноклеточная анемия, фенилкетонурия.

Хромосомные мутации – изменение строения хромосом: выпадение участка, удвоение участка, поворот участка на 180 градусов, перенос участка на другую (негомологичную) хромосому и т.п. Причины – нарушения при кроссинговере. Пример: синдром кошачьего крика.

Геномные мутации – изменение количества хромосом. Причины – нарушения при расхождении хромосом.

Полиплоидия – кратные изменения (в несколько раз, например, 12 → 24). У животных не встречается, у растений приводит к увеличению размера.
Анеуплоидия – изменения на одну-две хромосомы. Например, одна лишняя двадцать первая хромосома приводит к синдрому Дауна (при этом общее количество хромосом – 47).

Цитоплазматические мутации – изменения в ДНК митохондрий и пластид. Передаются только по женской линии, т.к. митохондрии и пластиды из сперматозоидов в зиготу не попадают. Пример у растений – пестролистность.

Соматические – мутации в соматических клетках (клетках тела; могут быть четырех вышеназванных видов). При половом размножении по наследству не передаются. Передаются при вегетативном размножении у растений, при почковании и фрагментации у кишечнополостных (у гидры).

Что, если бы…?

Около 99% нашей генетической информации такая же, как и других людей на планете. Гены определяют пол, цвет кожи и волос, наличие определенных заболеваний или иммунитет к ним и, по данным ряда исследований, даже способность влюбляться с первого взгляда.

Похожее по теме… Структура и функции ДНКВсе, что нужно знать об открытии, редактировании и функциях ДНК.

Рассказывается о самых фундаментальных аспектах ДНК, особенно о тех, при изучении которых особую роНо тот 1%, который остается в итоге, представляет особенный интерес.

Вариации генов могут дать нам если не суперспособности, то качества, которые есть далеко не у всех. Спортивный ген

У каждого из нас есть ген ACTN3, но определенные его варианты помогают организму вырабатывать особый белок — альфа-актинин-3.

Этот белок контролирует мышечные волокна, а также клетки, ответственные за быстрое натяжение и изгиб мышц, использующихся при беге или работе с весом.

Ученые открыли эту особенность некоторых людей в 2008 году, обнаружив, что именно вариант ACTN3, тут же названный спортивным геном, порой помогает профессиональным бегунам и атлетам показывать отличные результаты.

Около 99% нашей генетической информации такая же, как и других людей на планете. Гены определяют пол, цвет кожи и волос, наличие определенных заболеваний или иммунитет к ним и, по данным ряда исследований, даже способность влюбляться с первого взгляда.

Но тот 1%, который остается в итоге, представляет особенный интерес. Вариации генов могут дать нам если не суперспособности, то качества, которые есть далеко не у всех.

Спортивный ген

У каждого из нас есть ген ACTN3, но определенные его варианты помогают организму вырабатывать особый белок — альфа-актинин-3.

Этот белок контролирует мышечные волокна, а также клетки, ответственные за быстрое натяжение и изгиб мышц, использующихся при беге или работе с весом.

Ученые открыли эту особенность некоторых людей в 2008 году, обнаружив, что именно вариант ACTN3, тут же названный спортивным геном, порой помогает профессиональным бегунам и атлетам показывать отличные результаты.

[attention type=yellow]

Сон четыре часа в сутки

[/attention]Представьте себе, что вы можете чувствовать себя полностью отдохнувшим всего после 4 часов сна в течение ночи. Для некоторых людей это совершенно нормально, и дело здесь, опять-таки, в генетике.

Исследователи полагают, что за способность к почти моментальному восстановлению ответственен ген HDEC2. Логично предположить, что у людей, которые быстро высыпаются, и родители проявляют те же удивительные «способности».

Невероятно крепкие кости

Исследования показали, что определенные варианты гена LRP5, регулирующего плотность костно-минеральной ткани в организме, приводят к чрезмерной хрупкости и слабости костей.

Следствием могут быть такие диагнозы, как детский остеопороз и синдром остеопороза-псевдоглиомы (заболевание, связанное как со снижением прочности костей, так и с ухудшением зрения).

Однако другой тип мутации LRP5 может иметь прямо противоположный эффект — и человек станет обладателем костей, которые почти невозможно сломать.

Низкий холестерин

Несмотря на то, что рацион и уровень физической активности — главные факторы, влияющие на уровень холестерина в крови, генетика также играет здесь важную роль.

Причина в мутациях гена, ответственного за продуцирование белка, переносящего эфиры холестерина (CETP). В этом случае уровень хорошего холестерина (ЛВП) повышается, а холестерин быстрее попадает в печень и выводится из организма.

Итог — низкий уровень холестерина в целом и минимальный риск ишемической болезни сердца.

Еще больше кофе

Похожее по теме… ГенетикаГенетика — наука о закономерностях наследственности и изменчивости.Существует как минимум шесть генов, связанных со способностью нашего тела обрабатывать поступающий в него кофеин.

Варианты некоторых генов, например BDNF и SLC6A4, влияют на полезный мочегонный эффект кофеина, который заставляет нас пить больше воды всего после одной чашки кофе. Другие мутации влияют на метаболические процессы: это объясняет, почему одни люди не могут заснуть после эспрессо, выпитого в 16.

00, а другие будут сладко спать даже после двойного американо, выпитого прямо перед сном.

Возможно, вы не знали, но супергерои вроде тех, что показывают в фильмах «Мстители» и «Люди Х», существуют в реальном мире. Впрочем, в отличие от кино, сверхчеловеческими способностями их наделяет не взрыв реактора или «волшебная сыворотка», но разного рода генетические мутации.

Ниже — самые необычные последствия подобных нарушений. От способности видеть более 100 миллионов оттенков цвета до невозможности поправиться.

Мощные вкусовые рецепторы

Medical Daily приводит данные исследований, согласно которым около 25% людей имеют предрасположенность к более ярким вкусовым ощущениям. Особенно это касается горького вкуса, который при мутации генов становится крайне интенсивным. Ученые полагают, что мутация возникла много лет назад в качестве защитного фактора, позволявшего нашим предкам определять ядовитые растения «на зуб».

Иммунитет к боли

Врожденная нечувствительность к боли (сенсорная нейропатия) является редким генетическим нарушением, при котором человек не способен чувствовать боль, даже если он сломал кость, обжегся или получил какую-либо другую травму.

Она вызывается мутацией в гене SCN11A, снижающей количество натрия в клетках организма, что, в свою очередь, лишает тело способности передавать сигнал о боли в мозг.

По данным исследований, врожденной нечувствительностью к боли страдают около 100 человек по всему миру.

Рентгеновское зрение

Тетрахроматия — способность видеть излучения, выходящие за пределы видимого человеческим глазом спектра, и различать цвета, которые обычный человек характеризует как одинаковые.

Такой особенностью строения глаза обладают некоторые виды птиц, рыб и насекомых, а также ограниченное число людей с мутацией генов, отвечающих за синтез опсинов.

Для сравнения: если мы с вами можем различать около миллиона цветов, но глазу тетрахроматика доступны 100 миллионов.

Устойчивость к набору веса

Неспособность набрать вес может показаться сбывшейся мечтой, однако на самом деле речь идет о серьезном заболевании, сопряженном с множеством проблем.

MDP-синдром — крайне редкое явление, характеризующееся отсутствием в организме подкожного жира.

Этим синдромом страдает всего 8 человек в мире, включая двукратного победителя паралимпийских игр Тома Стэнифорда (Tom Staniford), и все они подвержены высокому риску переломов и диабета.

Двойное количество мышц

Люди, которые имеют генетическую мутацию в гене MSTN, могут похвастаться увеличенной мышечной массой. Работа MSTN заключается в производстве миостатина — белка, который подавляет рост и дифференцировку мышечной ткани, когда ее достаточно.

Именно поэтому, когда ген мутирует, рост мышц не прекращается, а как раз наоборот. Врачи говорят, что у людей с подобным генетическим нарушением по крайней мере в два раза больше мышц, чем у среднестатистического человека их пола и возраста.

Источник: https://page.maple4.ru/inoe/stati/interesnoe/1291-mutaczii.html

Векторы флуоресцентных белков и перенос генов

Плазмидные мутации

24 Марта 2017

В живых клетках флуоресцентные белки обычно используются для наблюдения местоположения и динамики белков, органелл и других клеточных компартментов.

Было разработано много различных методик для гибридизации флуоресцентных белков и усиления их экспрессии в клетках млекопитающих и других системах.

Основным средством доставки химерных генетических последовательностей флуоресцентных белков в клетки являются бактериальные плазмиды и вирусные векторы, полученные методами генной инженерии.

Гены флуоресцентных белков могут быть введены в клетки млекопитающих и другие клетки с помощью соответствующих временных или стабильных векторов (обычно это плазмиды или вирусы).

В экспериментах по временной экспрессии генов (часто называемых врeменной трансфекцией) ДНК плазмид или вирусов, введённых в организм-хозяин, не обязательно сливаются с хромосомами, но могут экспрессироваться в цитоплазме в течении короткого периода времени.

Экспрессия слитых (гибридных) генов, легко отслеживаемая по флуоресцентному свечению с помощью фильтрационных блоков, соответствующих данному флуоресцентному белку, начинается в течении нескольких часов после трансфекции и продолжается от 72 до 96 часов после введения ДНК плазмид в клетки млекопитающих.

[attention type=red]

Во многих случаях ДНК плазмид могут быть введены в геном устойчивым образом, что порождает стабильные трансформированные клеточные линии. Выбор между временной и стабильной трансфекцией зависит от объектов-мишеней в данном эксперименте.

[/attention] Для подробного ознакомления с медицинской и исследовательской техникой основных мировых производителей оптических систем и сопутствующего оборудования посетите наш каталог или свяжитесь с нашими специалистами и получите полную профессиональную консультацию по любым, имеющимся у Вас, вопросам. 

Базовая конфигурация плазмидного вектора, способного обеспечить перенос генов флуоресцентного белка, имеет несколько необходимых компонентов. Плазмиды должны содержать нуклеотидные последовательности прокариотной клетки, кодирующие начало репликации ДНК в бактерии, и ген устойчивости к антибиотику.

Эти элементы, часто называемые челночными последовательностями, обеспечивают размножение и отбор плазмид в бактерии-хозяине для производства необходимого количества векторов для трансфекции в клетки млекопитающих.

В дополнение, плазмиды должны содержать один или несколько эукариотических генетических элементов для управления началом транскрипции информационной РНК, сигнал полиаденилирования в клетках млекопитающих, интрон (необязательно) и ген для ко-селекции в клетках млекопитающих.

Транскрипционные элементы необходимы для экспрессии представляющего интерес гибридного белка в клетке-хозяине млекопитающего, а селективным геном обычно является антибиотик, обеспечивающий устойчивость содержащих плазмиды клеток. Эти общие условия могут меняться в зависимости от назначения плазмид, и многие векторы имеют широкий спектр дополнительных компонентов, необходимых для конкретных приложений.

Рис. 7. Рестрикционный фермент и генетическая карта деривата бактериальной плазмиды, содержащей кодирующую последовательность усиленного жёлтого флуоресцентного белка, слитого с последовательностью выступающего в качестве мишени калретикулина (резидентного белка) эндоплазматической сети

На рисунке 7 представлен рестрикционный фермент и генетическая карта серийно выпускаемого (БД Биосайенсис Клонтек) деривата бактериальной плазмиды, содержащей кодирующую последовательность усиленного жёлтого флуоресцентного белка, слитого с последовательностью выступающего в качестве мишени калретикулина (резидентного белка) эндоплазматической сети. В результате экспрессии этого генного продукта в восприимчивых клетках млекопитающих возникает содержащий EYFP химерный пептид, локализованный в мембране эндоплазматической сети и специально разработанный для флуоресцентного окрашивания этой органеллы. Вектор-хозяин является дериватом высококопийной плазмиды pUC (приблизительно 500 копий), содержащей бактериальный репликатор, обеспечивающий размножение специальных штаммов E. сoli. Ген антибиотика канамицина, экспрессированный в бактерии, сообщает ей устойчивость в качестве селективного маркера.

Вектор EYFP, представленный выше, дополнительно содержит промотор цитомегаловируса (CMV) человека для обеспечения экспрессии генов в линии трансфектированных клеток человека и млекопитающих, а также репликатор бактериофага f1 для производства однонитевых ДНК.

[attention type=green]

Векторный остов также включает в себя репликатор обезьяньего вируса (ОВ-40), активного в клетках млекопитающих, которые экспрессируют Т-антиген вируса ОВ-40.

[/attention]

Селекция устойчивых к антибиотику G418 трансфектантов обеспечивается кассетой, кодирующей резистентность к неомицину и состоящей из раннего промотора ОВ-40, гена устойчивости к неомицину (аминогликозид 3'-фосфотрансферазы) и сигналов полиаденилирования для вируса простого герпеса тимидинкиназы (ТК ВПГ) для стабильности мРНК. Для большей степени универсальности плазмиды в её остове (см. рисунок 7) присутствуют шесть уникальных рестрикционных ферментов.

Размножение, выделение и трансфекция плазмид флуоресцентных белков

Успешная трансфекция в клетках млекопитающих зависит от того, насколько чистыми и свободными от бактериальных эндотоксинов будут применяемые в эксперименте плазмидные или вирусные векторы. В нативном состоянии молекула кольцевой плазмидной ДНК представляет собой третичную сверхспиральную структуру, в которой двойная спираль закручена вокруг себя несколько раз.

В течение лет методом очистки сверхспиральных плазмидных и вирусных ДНК было центрифугирование в градиенте плотности хлористого цезия в присутствии интеркалирующего агента (например, бромистого этидия или йодида пропидия).

Этим методом, затратным с точки зрения как оборудования, так и материалов, сверхспиральная (плазмидная) ДНК разделяется на линейную хромосомную и разорванную кольцевую ДНК в соответствии с плавучей плотностью, позволяя собирать плазмидные ДНК высокой степени очистки.

Недавно, этот громоздкая и долгая процедура центрифугирования была заменена упрощённым методом ионообменной хроматографии (обычно называемым mini-prep), позволяющим получать свободные от эндотоксинов плазмидные ДНК относительно быстро и в больших количествах.

Специальные бактериальные мутанты, называемые компетентными клетками, были разработаны для удобного и относительно недорогого умножения плазмидных векторов.

Благодаря набору специальных мутаций эти бактерии особенно восприимчивы к репликации плазмид, а химически нарушенная проницаемость их мембраны обеспечивает перенос (называемый трансформацией) ДНК через саму мембрану и клеточную оболочку.

После трансформации бактерии выращиваются до логарифмической фазы в присутствии антибиотика, с помощью которого осуществляется отбор, управляемый плазмидами с кодом этого антибиотика. Бактериальная культура уплотняется центрифугированием и лизируется раствором щелочного моющего средства, содержащего ферменты для очистки от РНК.

[attention type=yellow]

После этого лизат фильтруется и помещается на ионообменную колонку. Нежелательные компоненты, включая РНК, ДНК и белки, тщательно вымываются из колонки перед тем, как ДНК плазмид извлекаются с помощью высокосолевого буфера. После этого извлечённые ДНК плазмид осаждаются в спиртовом растворе (изопропаноле), собираются центрифугированием, промываются и опять растворяются в буфере. Очищенные таким образом ДНК готовы для экспериментов по трансфекции.

[/attention]

Рис. 8. Липидная трансфекция в клетки млекопитающих

Клетки млекопитающих, используемые для трансфекции, должны быть в превосходном физиологическом состоянии и находиться в логарифмической фазе роста. Для оптимизации внедрения плазмидных ДНК в культивируемые клетки были разработаны многочисленные трансфекционные реагенты, выпускаемые сегодня серийно.

Методики внедрения разнообразны: от простого осаждения фосфатом кальция до связывания плазмидных ДНК липосомами, которые проникая сквозь клеточную мембрану, доставляют содержимое в цитоплазму (как показано на рисунке 8).

Обобщённо называемые липофекцией, методы с использованием липидов получили широкое распространение благодаря своей эффективности для большого количества популярных клеточных линий и применяются сегодня в большинстве экспериментов по трансфекции.

При врeменной трансфекции потеря плазмидного гена происходит обычно в течение относительно короткого периода (несколько дней), в то время как стабильные линии трансфектированных клеток вырабатывают «гостевые» белки достаточно долго (от нескольких месяцев до нескольких лет).

Стабильные клеточные линии могут отбираться с помощью антибиотических маркеров в плазмидном остове (см. рисунок7). Одним из наиболее распространённых антибиотиков для селекции стабильных трансфектантов в линиях клеток млекопитающих является лекарственный препарат G418, подавляющий синтез белков, не его доза значительно меняется в зависимости от клеточной линии.

Для селекции стабильных клеток были разработаны и другие часто применяемые антибиотики, включая гидромицин B и пуромицин, которые тоже имеют генетические маркеры. Эффективность получения стабильных клеточных линий определяется эффективностью начальной трансфекции.

[attention type=red]

Электропорация, в этом отношении, оказалась надёжным способом получения стабильных трансфектантов линеаризованными плазмидами и очищенными генами.

[/attention]

Метод электропорации заключается в пропускании коротких импульсов высокого напряжения через клеточную суспензию, в результате чего в плазматических мембранах образуются поры, через которые трансфекционные ДНК попадают в клетки. Процедура электропорации требует специального оборудования, тем не менее, его стоимость сравнима с затратами на липофекционные реагенты при выполнении большого числа трансфекций.

Будущее флуоресцентных белков

Современное развитие флуоресцентных белков идёт по двум основным направлениям.

Первое — окончательная «доводка» существующей палитры (от синих до жёлтых) флуоресцентных белков, полученных из медузы Aequorea victoria, а второе — усовершенствование мономерных флуоресцентных белков, испускающих в видимом диапазоне от оранжевого до дальнего красного. Прогресс, достигнутый в этих направлениях, действительно впечатляет, и появление на горизонте ближних инфракрасных флуоресцентных белков уже не кажется невообразимым.

Последнее поколение белков, выделенных из медузы, во многом восполнило дефицит первых флуоресцентных белков, особенно жёлтых и зелёных дериватов. Поиск мономерного, яркого и быстро созревающего красного флуоресцентного белка привёл к нескольким новым и интересным классам флуоресцентных белков, особенно тех, которые были выделены из кораллов.

Дальнейшее расширение цветовой палитры происходит как за счёт развития существующих флуоресцентных белков, так и благодаря новым технологиям, например, внедрению искусственных аминокислот.

А поскольку оптические методы спектрального разделения продолжают развиваться и становятся более распространёнными, эти новые варианты обязательно дополнят существующую палитру, особенно в жёлтом и красном участках спектра.

Сегодня в технологии флуоресцентных зондов имеет место тенденция к повышению роли красителей, флуоресцирующих в дальнем красном и ближнем инфракрасном. В клетках млекопитающих и автофлуоресценция, и поглощение света резко сокращаются на красном конце спектра.

Таким образом, развитие дальних красных флуоресцентных красителей будет чрезвычайно полезным для исследования толстых образцов и животных целиком.

В случае успешного использования флуоресцентных белков в качестве репортерных молекул в трансгенных системах, применение красных флуоресцентных белков в целых организмах станет в ближайшие годы чрезвычайно важным.

Наконец, только сейчас начинает осознваться огромный потенциал приложения флуоресцентных белков для создания биосенсоров. Количество различных биосенсоров стремительно растёт.

[attention type=green]

Использование структурной информации приводит к постоянному повышению их чувствительности.

[/attention]

Успехи в этом направлении вселяют уверенность в том, что почти любой биологический параметр можно будет измерить биосенсором на базе соответствующего флуоресцентного белка.

Источник: https://www.microsystemy.ru/info/articles/vektory-fluorestsentnykh-belkov-i-perenos-genov/

Мутации – Биология Егэ

Плазмидные мутации

Наследственная (генотипическая) изменчивость проявляется в изменении генотипа особи, поэтому передается при половом размножении потомкам.

Наследственная изменчивость обусловлена возникновением разных типов мутаций и их комбинаций в последующих скрещиваниях. В каждой достаточно длительно существующей совокупности особей спонтанно и ненаправленно возникают различные мутации, которые в дальнейшем комбинируются более или менее случайно с уже имеющимися вариантами генов.

Виды наследственной изменчивости:

  • комбинативная: обусловленная перекомбинированием генов в результате мейоза и оплодотворения;
  • мутационная: обусловленная возникновением мутаций. 

Комбинативная изменчивость

Комбинативной называют изменчивость, в основе которой лежит образованиерекомбинаций, т. е. таких комбинаций генов, которых не было у родителей.

В основе комбинативной изменчивости лежит половое размножение организмов, вследствие которого возникает огромное разнообразие генотипов. Практически неограниченными источниками генетической изменчивости в ходе полового размножения эукариот служат три процесса:

  1. Независимое расхождение гомологичных хромосом в анафазе первого деления мейоза. Именно независимое комбинирование хромосом при мейозе является основой третьего закона Менделя. Появление зеленых гладких и желтых морщинистых семян гороха во втором поколении от скрещивания растений с желтыми гладкими и зелеными морщинистыми семенами — пример комбинативной изменчивости.
  2. Взаимный обмен участками гомологичных хромосом, или кроссинговер, в профазе первого деления мейоза. Он создает новые группы сцепления, т. е. служит важным источником генетической рекомбинации аллелей. Рекомбинантные хромосомы, оказавшись в зиготе, способствуют появлению признаков, нетипичных для каждого из родителей.
  3. Случайное сочетание гамет при оплодотворении.

Эти источники комбинативной изменчивости действуют независимо и одновременно, обеспечивая при этом постоянную «перетасовку» генов, что приводит к появлению организмов с другими генотипом и фенотипом (сами гены при этом не изменяются). Однако новые комбинации генов довольно легко распадаются при передаче из поколения в поколение.

Комбинативная изменчивость является важнейшим источником всего колоссального наследственного разнообразия, характерного для живых организмов. Однако она, как правило, не порождает  стабильных изменений в генотипе, которые необходимы, согласно эволюционной теории, для возникновения новых видов.

Стабильные, долгоживущие изменения возникают в результате мутаций.

Мутационная изменчивость

Мутация — это устойчивое и ненаправленное изменение в геноме.

Мутация сохраняется неограниченно долго в ряду поколений.

Значение мутаций в эволюции огромно — благодаря им возникают новые варианты генов. Говорят, что мутации — это сырой материал эволюции. Мутации носят индивидуальный (каждая мутация в отдельной молекуле ДНК возникает случайно) и ненаправленный характер.

Мутации могут как приводить, так и не приводить к изменению признаков и свойств организма.

Мутации возникают постоянно на протяжении всего онтогенеза человека. Чем на более раннем этапе развития организма возникнет конкретная мутация, тем большее влияние она может оказать на развитие организма (рис. 1).

Рис. 1. Влияние мутаций в разные периоды онтогенеза

Мутации делятся на:

  • нейтральные;
  • вредные;
  • полезные.

Современные генетики считают, что большинство вновь возникающих мутацийнейтральны, то есть никак не отражаются на приспособленности организма.

Нейтральные мутации происходят в межгенных участках — интронах (участках ДНК, не кодирующих белки); либо это синонимичные мутации в кодирующей части гена — мутации, которые приводят к возникновению кодона, обозначающего ту же аминокислоту (это возможно из-за вырожденности генетического кода).

Следующими по частоте являются вредные мутации. Вредоносное действие мутаций объясняется тем, что изменения касаются наследственных признаков, имеющих чаще всего адаптивное значение, т. е. признаков, полезных в данных условиях среды.

Лишь небольшая часть мутаций повышает приспособленность организма, то есть является полезной («ломать не строить»).

Однако вредность и полезность мутаций — понятия относительные, т. к. то, что полезно (вредно) в данных условиях, может оказать обратное действие при изменении условий среды. Именно поэтому мутации являются материалом для эволюции.

Мутагенез — процесс возникновения мутаций.

Мутации могут появиться как в соматических, так и в половых клетках (рис. 2).

Рис. 2. Результат мутаций

Соматические мутацииГенеративные мутации
Не всегда передаются при половом размножении.Передаются при вегетативном (бесполом размножении).Передаются по наследству.

Не смотря на то, что мутации возникают постоянно, существует ряд факторов, так называемых мутагенов, увеличивающих вероятность появления мутаций.

Мутагены — факторы, увеличивающие вероятность появления мутаций.

Мутагенами могут быть:

  • химические вещества (кислоты, щелочи и т. п.);
  • температурные воздействия;
  • УФ-излучение;
  • радиация;
  • вирусы.

Канцерогены — факторы, повышающие вероятность возникновения злокачественных новообразований (опухолей) в организме животных и человека.

По характеру изменения генома различают мутации:

  • генные (точечные)
  • хромосомные
  • геномные

ГЕННЫЕ МУТАЦИИ

Генные, или точечные мутации — результат изменения нуклеотидной последовательности в молекуле ДНК в пределах одного гена.

Если такая мутация происходит в гене, это приводит к изменению последовательности иРНК. А изменение последовательности иРНК может привести к изменению последовательности аминокислот в полипептидной цепи. В результате синтезируется другой белок, а в организме изменяется какой-либо признак.

Это наиболее распространённый вид мутаций и важнейший источник наследственной изменчивости организмов.

Существуют разные типы генных мутаций, связанных с добавлением, выпадением или перестановкой нуклеотидов в гене:

  • дупликации — повторение участка гена,
  • вставки — появление в последовательности лишней пары нуклеотидов,
  • делеции –выпадение одной или более пар нуклеотидов,
  • замены нуклеотидных пар — AT ->

Источник: https://www.sites.google.com/site/biologiaege/zakonomernosti-izmencivosti-nenasledstvennaa-modifikacionnaa-izmencivost-norma-reakcii-nasledstvennaa-izmencivost-mutacionnaa-kombinativnaa-vidy-mutacij-i-ih-priciny-znacenie-izmencivosti-v-zizni-organizmov-i-v-evolucii

Генные мутации

Что такое ген? Это участок ДНК (т.е. несколько нуклеотидов), соответственно, это и участок РНК, и участок белка, и какой-либо признак организма.

Т.е. генная мутация – это выпадение, замена, вставка, удвоение, изменение последовательности участков ДНК.

Вообще, это не всегда ведет к болезни. Например, при удвоении ДНК случаются такие “ошибки”. Но они возникают редко, это очень малый процент от всего количества, поэтому они незначительны, что практически не влияют на организм.

Бывают и серьезные мутагенезы:- серповидно-клеточная анемия у человека;- фенилкетонурия – нарушение обмена веществ, вызывающее довольно серьезные нарушения умственного развития- гемофилия

– гигантизм у растений

Геномные мутации

Вот классическое определение термина “геном”:

Геном

– совокупность наследственного материала, заключенного в клетке организма;- геном человека и геномы всех остальных клеточных форм жизни, построены из ДНК;

– совокупность генетического материала гаплоидного набора хромосом данного вида в парах нуклеотидов ДНК на гаплоидный геном.

Для понимания сути мы очень сильно упростим, получится такое определение:

Геном – это количество хромосом

Геномные мутации – изменение числа хромосом организма. В основном, их причина – нестандартное расхождение хромосом в процессе деления.

– синдром Дауна – в норме у человека 46 хромосом (23 пары), однако при этой мутации образуются 47 хромосом
рис. синдром Дауна

– полиплойдия у растений (для растений это вообще норма – большинство культурный растений – полиплойдные мутанты)

Хромосомные мутации – деформации самих хромосом.

Примеры (некоторые перестройки такого рода есть у большинства людей и вообще никак не отражаются ни внешне, ни на здоровье, но есть и неприятные мутации):- синдром кошачьего крика у ребенка- задержка в развитии

и т.д.

Цитоплазматические мутации – мутации в ДНК митохондрий и хлоропластов.

Есть 2 органеллы со своими собственными ДНК (кольцевыми, в то время как в ядре – двойная спираль) – митохондрия и растительные пластиды.

Соответственно, есть мутации, вызванные изменениями именно в этих структурах.

Есть интересная особенность – этот вид мутации передается только женским полом, т.к. при образовании зиготы остаются только материнские митохондрии, а “мужские” отваливаются с хвостом при оплодотворении.

Примеры:- у человека – определенная форма сахарного диабета, туннельное зрение;

– у растений – пестролистность.

Соматические мутации

Это все описанные выше виды, но возникают они в клетках тела ( в соматических клетках).
Мутантных клеток обычно намного меньше, чем нормальных, и они подавляются здоровыми клетками. (Если не подавляются, то организм перерождаться или болеть).

Примеры:- у дрозофилы глаз красный, но может иметь белые фасеты

– у растения это может быть целый побег, отличающийся от других (И.В. Мичурин таким образом выводил новые сорта яблок).

– раковые клетки у человека

Примеры вопросов ЕГЭ:

Синдром Дауна является результатом мутации

1))геномной;

2) цитоплазматической;

3)хромосомной;

4) рецессивной.

Ответ: 1.

Генные мутации связаны с изменением

А) числа хромосом в клетках;

Б) структуры хромосом;

B) последовательности генов в аутосоме;

Г) нуклеогидов на участке ДНК.

Ответ: Г.

Мутации, связанные с обменом участками негомологичных хромосом, относят к

А) хромосомным;

Б) геномным;

В) точковым;

Г) генным.

Ответ: А.

Животное, в потомстве которого может появиться признак, обусловленный соматической мутацией

А) гидра

Б) волк

В) еж

Г) выдра

Ответ: А.

Источник: https://ege-study.ru/ru/ege/materialy/biologiya/mutacii/

Лечимся дома
Добавить комментарий

;-) :| :x :twisted: :smile: :shock: :sad: :roll: :razz: :oops: :o :mrgreen: :lol: :idea: :grin: :evil: :cry: :cool: :arrow: :???: :?: :!: